二)siRNA的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成,体外转录,长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA,以及通过siRNA表达载体或者病毒载体,PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。 1. 化学合成生产siRNA优点:方便,研究人员几乎不需要做什么工作。缺点:价格较贵,效率只有转录合成的shRNA的1/10-1/40,基因抑制持续时间短,对细胞毒性大,转染效率低,此外由于合成工艺上存在不可弥补的缺陷,此方法不能合成shRNA,不能纠正合成中产生的20%左右的碱基错误。适用于:建议不再采用此种合成方法。不适用于:基本上对目前所有的实验室来说均不适用。评价:☆☆☆☆☆ 2. 生物合成转录生产编码siRNA优点:价格较低,抑制效率高,低浓度的siRNA即可达到抑制效果。体外转录合成,比较接近生理状态。缺点:无法保证有效性,实验规模受到限制,不能进行大量的生产,不能维持长时间抑制效应,而且需要用户参与操作,难以保证实验的一次成功性。适用于:筛选siRNAs特别是需要制备多种siRNAs,考虑合成价格时。不适用于:实验需要大量的一个特定的siRNA。长期研究。评价:★★★☆☆ 尽管有些公司推出了shRNA和siRNA试剂盒,但这些试剂盒大都突出操作简单,毕竟涉及RNA操作,用户自己难免会产生很多预料不到的困难,晶赛公司可以完全为您解决后顾之忧,您可以直接拿到有效的siRNA或shRNA序列。 3. Dicer酶法生产siRNA优点:可以跳过筛选与检测有效siRNA序列的步骤,节省时间和开支。缺点:有可能引发非特异性的基因沉默,尤其是同源或者密切相关的基因。适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于:长期研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究评价:★★★☆☆ 4.编码shRNA的载体生产siRNA优点:制备质量可控性好,带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久,可以大量扩增。缺点:转录后的shRNA的正确折叠率不能保证,有可能因此造成非特异性抑制,质粒载体转染效率不稳定,与细胞类型有关。适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作评价:★★★★☆ 晶赛公司拥有一项编码shRNA的载体生产siRNA的技术,zui多可以一次编码6个目标基因的siRNA序列,为您节省了筛选时间,保证了siRNA的有效性。具体详情:images/beinuo/ 确立需要干扰的目标基因2. 检查使用细胞的转染情况可以选择一个4kb左右大小的质粒和可实施的转染方法,检测转染效率转染效率超过40%:可以选择任何一种RNA干扰方法。转染效率介于10%-40%:可以选用体外合成的si RNA或者带有筛选标记的shRNA质粒表达载体。转染效率低于10%:带有筛选标记的shRNA质粒表达载体或病毒载体。3. si RNA序列选择设计制备20-30个si RNA序列,选择有效序列或委托专业化公司(如:晶赛生物)设计(3个序列保证1个有效)4. 开始实验三、RNAi的应用前景1. 研究基因功能的新工具已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势,近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多,标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 2. 研究信号传导通路的新途径联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关系, 证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好,克服了转 染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点, 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。 3.开展基因治疗的新策略RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量增殖等作用,因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。 尽管目前RNAi技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段,但它在斑马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着RNAi将成为基因治疗中重要的组成部分,人工合成的dsRNA寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。